師姐,我的細胞又被污染了!

你是不是因為細胞污染影響實驗進度而鬱悶,還因此被老板批評?可以說,大家都是抗污染過來的,心態要好,不會是第一次,也不會是最後一次,隨時做好細胞被污染的準備。


今天我們就來備戰:是不是細胞污染?是哪種細胞污染?如何識別?

細菌污染

細胞中如果污染細菌,最常見的有枯草桿菌等革蘭陽性菌以及大腸桿菌、假單孢菌等革蘭陰性菌,其中又以白色葡萄球菌較常見。培養細胞受細菌污染後,會很快出現培養液變混濁,pH 改變。

也有少數培養液肉眼觀察無多少改變,只能在鏡下發現菌體才知污染。所以,每天應仔細觀察。污染後細胞發生病理改變,胞內顆粒增多、增粗,最後變圓脫落死亡,造成實驗失敗和細胞株(系)丟失。

細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,根據感染細菌的不同,可有不同的外形,培養液一般會渾濁變黃,對細胞生長影響明顯。


如何預防

  • 仔細檢查一下器皿的滅菌情況,是否在高壓滅菌時放氣時間足夠、壓力足夠。

  • 重點檢查和儲存培養液接觸的移液管等物品,連續兩次污染的話有可能造成儲存液污染,一定要注意。

  • 下次使用前檢查一下培養液是否存在渾濁的現象,可在培養液中加相應的抗生素處理。

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白色念球菌污染

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革蘭氏染色陽性,中間長梭型的是正在分裂的念珠菌

黴菌污染


黴菌污染以後,培養液是清亮的,倒置顯微鏡下無雜質,37 度孵箱培養 2-3 天,仍清亮,但出現絮狀雜質。鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物,可看到明顯的菌絲,細胞仍可生長,但時間長之後,細胞的活力狀態變差。


用硫酸銅溶液擦拭 CO2 孵箱內,再把水盤裡也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體, 可以防止黴菌污染。


CO2 孵箱被黴菌污染後,可把所有細胞暫時轉移,採用過氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。並把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時,使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散後,再移入細胞。孵箱應定期清潔(2 月左右),尤其在多雨的季節。

其它培養箱清洗方法是:用 84 液擦洗-清水擦洗-75% 酒精擦洗-紫外燈照。


如何預防

  • 可在培養基裡加 3u/mL 的兩性黴素或制黴菌素或放線菌素 D 或雙抗。

  • 細胞一旦污染,很難挽救,制黴菌素或放線菌素 D 或雙抗都於事無補,建議捨棄該污染細胞。

  • 將環境徹底消毒,如果所有細胞都污染,可能是系統污染,檢查一下培養基和器材,如果只是個別污染,可能是操作問題,就要注意操作。

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內皮細胞培養中發現的一個黴菌

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黴菌污染

上圖是典型的黴菌污染,肉眼看到白色的團塊或白點,鏡下呈絲狀。400 倍圖片如上。

支原體污染

支原體感染細胞以後,細胞病變不很明顯,只是慢慢死去。培養液一般會渾濁。


國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測,而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。可用泰樂菌素——獸用支原體病的藥,無任何不良反應。如果用的是 Sigma 公司的,使用時用 50u g/mL Tylosin 培養液培養 6 天或連續傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用 8 ug/mL 的濃度。

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支原體污染

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支原體污染電鏡照片,煎蛋狀和其他形狀

黑膠蟲污染

黑膠蟲可以穿透濾膜,也可以通過空氣傳播。低倍下為黑色點狀,高倍下可看見黑色的小蟲遊來遊去。培養液也是不渾的,一般不會太影響,細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態良好,且觀測到的運動物無明顯增多,且培養液顏色、透明度無明顯變化,可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象。對細胞生長狀態不會有明顯影響,在細胞增殖旺盛之後會自然消失。

除更換血清外無須特殊處理。建議如果細胞有可能是此種污染的話,可以增加細胞的種板密度,以提高細胞的生存率。

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黑膠蟲污染

真菌污染

一般培養液清亮,不變色,鏡下有絲狀物,有些真菌開始很像死細胞碎片,只是它很多很多的小塊很清楚,象珊瑚狀,不象細胞碎片分不清,慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。

真菌生長的比較慢,不象細菌那麼容易被發現,但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了,也很難救活了。

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真菌污染

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高倍鏡下的真菌污染

原蟲污染

培養液可輕微渾濁,顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多,輕微活動,細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,而且細胞狀態不好,邊緣不清楚,細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這種共生是非常普遍的,但他們的數量小,細胞占優勢所以不會影響到細胞的正常生長,只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長,最終形成惡性循環。

污染的可能原因:配液消毒問題、操作問題、環境問題等等。

關於培養基的無菌狀況,取培養基至培養瓶中(不加細胞),37 度試培養一段時間後觀察。如果沒有細菌生長 就是操作的問題。也可以在培養基中事先加入雙抗(硫酸鏈黴素和氨芐青黴素)。但雙抗有時會影響細胞的狀態,所以在做轉染、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗,以避免影響實驗結果。

如何預防

  • 孵箱應定期用三氧機消毒或者紫外光照射,並用酒精和新潔爾滅試擦孵箱,同時孵箱內的水應是三蒸水。

  • 超淨台、取材、器材、培養液、培養瓶、操作等因素

  • 超淨台的風機不能過大,風機到 6-8 格。否則也可能能致黴菌污染。

  • 無菌室經甲醛熏蒸消毒後,可用同等量的氨水噴灑中和,約幾小時即可進入操作。

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如何拯救被污染的細胞


作者:yuy05
配圖來源:丁香園及網路

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