微生物培養與分離方法

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大多數細菌均可以通過人工方法培養,而衣原體和病毒的分離培養往往需要活組織、雞胚、特殊細胞株及動物接種。只有將微生物培養出來才能對它進行研究、鑒定和應用。


一、接種與分離方法

根據待檢標本的性質、培養目的和所用培養基的種類,採用不同的接種方法。


1.平板劃線分離培養法


對混有多種細菌的臨床標本,採用劃線分離和培養,使原來混雜在一起的細菌沿劃線在瓊脂平板表面分離,得到分散的單個菌落,以獲得純種。臨床送檢的標本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。平板劃線分離法通常有兩種方法:

1)分區劃線分離法:此法常用於含菌量較多的標本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細菌的分離。先用接種環挑取標本塗布於瓊脂平板1區(占培養基總面積的¼)並作數條劃線,再於234區依次劃線。每劃完一個區域,均將接種環燒灼滅菌1次,冷後再劃下一區域,每一區域的劃線均與上一區域的劃線交接1~3次。一個成功分區劃線的平板,培養後分別觀察1區形成菌苔,2區菌落連成線,3區和4區可分離到單個菌落


2)連續劃線分離法:此法常用於含菌量不多的標本或培養物中的細菌分離培養。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕塗抹,然後再用接種環或拭子在平板表面曲線連續劃線接種,直至劃滿瓊脂平板表面。


瓊脂斜面接種法

主要用於菌落的移種,以獲得純種進行鑒定和保存菌種等。用接種環(針)挑取單個菌落或培養物,從培養基斜面底部向上劃一條直線,然後再從底部沿直線向上曲折連續劃線,直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養基斜面接種,用接種針挑取待鑒定細菌的菌落,從斜面中央垂直刺入底部,抽出後在斜面上由下至上曲折劃線接種。



3.穿刺接種法


此法多用於半固體培養基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養基接種,半固體培養基的穿刺接種可用於觀察細菌的動力。接種時用接種針挑取菌落,由培養基中央垂直刺入至距管底0.4cm處,再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養基,穿刺高層部分,退出接種針後直接劃線接種斜臉部分。


4.液體培養基接種法

用於各種液體培養基如肉湯、蛋白腖水、糖發酵管等的接種。用接種環挑取單個菌落,傾斜液體培養管,在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立後液體淹沒接種物為準)。此接種法應避免接種環與液體過多接觸,更不應在液體中混勻、攪拌,以免形成氣溶膠,造成實驗室污染。



5.傾註平板法


本法主要用於飲水、飲料、牛乳和尿液等標本中的細菌計數。取純培養物的稀釋或原標本1ml至無菌培養皿內,再將已融化並冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養基15~20ml傾注入該無菌培養皿內,混勻,待凝固後置37℃培養,長出菌落後進行菌落計數,以求出每毫升標本中所含菌數。先數6個方格(每格為1cm2)中菌落數,求出每格的平均菌落數,並算出平皿直徑,然後按下列公式計數,求出每毫升標本中的細菌數。


全平板菌落數=每方格的平均菌落數×лr2


ml標本中的細菌數=全平板菌落數×稀釋倍數


6.塗布接種法


本法多用於紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養基表面,然後用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子於不同的角度反復塗布,使被接種液均勻分布於瓊脂表面,然後貼上藥敏紙片,或直接培養,本法經培養後細菌形成菌苔。

二、細菌的培養方法

根據不同的標本及不同的培養目的,可選用不同的培養方法。通常把細菌的培養方法分為需氧培養、二氧化碳培養、微需氧培養和厭氧培養四種。



1.需氧培養

是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養,將已接種好的平板、斜面、液體培養基等在空氣中置35℃孵育箱內孵育18~24h,無特殊要求的細菌均可生長。少數生長緩慢的細菌需要培養3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內保持一定的濕度,可在其內放置一杯水。對培養時間較長的培養基,接種後應將試管口塞好棉塞或矽膠塞後用石蠟凡士林封固,以防培養基幹裂。



2.二氧化碳培養


某些細菌,如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養,特別是在初次分離時,須在5%~10 %二氧化碳環境中培養才能生長。常用的培養法如下。

1)二氧化碳培養箱法:二氧化碳孵箱能自動調節二氧化碳的含量、溫度和濕度,培養物置於孵育箱內閣,孵育一定時間後可直接觀察生長結果。



2)燭缸培養法:取有蓋磨口標本缸或玻璃乾燥器,將接種好的培養基放入缸內,點燃蠟燭後放在缸內稍高於培養物的位置上,缸蓋或缸口均塗以凡士林,加蓋密閉。因缸內蠟燭燃燒氧逐漸減少,數分鐘後蠟燭自行熄滅,此時容器內二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置於35℃普通孵育箱內孵育。


3)氣袋法:選用無毒透明的塑膠袋,將已接種標本的培養皿放入袋內,盡量祛除袋內空氣後將開口處折疊並用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態,執斷袋內已置的二氧化碳產氣管(安瓿)產生二氧化碳,數分鐘內就可達到需要的二氧化碳培養環境,置於35℃孵育箱內孵育。


4)化學法:常用碳酸氫鈉鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例,分別置容器內,連同容器置於玻璃缸內,蓋緊密封,傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。於35℃孵育箱內孵育。


3.微需氧培養


微需氧菌培養在大氣中及絕對無氧環境中均不能生長,在含有5%-6% 氧氣,5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環境中才可生長,將標本接種到培養基上,置於上述氣體環境中,35℃進行培養即微需氧培養法。


4.厭氧培養

厭氧菌對氧敏感,培養過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環境。厭氧培養常用的方法有:物理法、化學法、生物法。如厭氧罐培養法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。


三、細菌在培養基上生長特性

1.固體培養基


標本或液體培養物劃線接種到固體培養基表面後,單個細菌經分裂繁殖可形成一個肉眼可見的細菌集團,稱為菌落(colony)。


(1)菌落的形態特徵:大小、形狀(露滴狀、圓形、菜花樣、不規則等)、突起或扁平、凹陷、邊緣(光滑、波形、鋸齒狀、捲髮狀等)、顏色(紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等)、表面(光滑、粗糙等)、透明度(不透明、半透明、透明等)和黏度等。據細菌菌落表面特徵不同,可將菌落分為3型:①光滑型菌落(S型菌落):菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊,新分離的細菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落(R型菌落):菌落表面粗糙、乾燥、呈皺紋或顆粒狀,邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質形成。R型細菌抗原不完整,毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。但也有少數細菌新分離的毒力株就是R型,如炭疽孢桿菌、結核分枝菌等。③黏液型菌落(M型菌落):菌落黏稠、有光澤、似水珠樣。多見於厚莢膜或豐富黏液層的細菌、結核桿菌等。



(2)菌落溶血特徵:菌落溶血有下列3種情況。①α溶血:又稱草綠色溶血,菌落周圍培養基出現1~2mm的草綠色環,為高鐵血紅蛋白所致;②β溶血:又稱完全溶血,菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環,是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致;③γ溶血:即不溶血,菌落周圍的培養基沒有變化,紅細胞沒有溶解或缺損。(3)色素:有些細菌產生水溶性色素,使菌落和周圍的培養基出現綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色,產生的色素有水溶性或脂溶性。


(4)氣味:某些細菌在培養基中生長繁殖後可產生特殊氣味,如銅綠假單胞菌(生薑氣味)、變形桿菌(巧克力燒焦的臭味)、厭氧梭菌(腐敗的惡臭味)、白色假絲酵母菌(酵母味)和放線菌(泥土味)等。
2.液體培養基


細菌在液體培養基中有3種生長現象:大多數細菌在液體培養基生長繁殖後呈均勻混濁;少數鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長;枯草芽胞桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長,常形成菌膜。


3.半固體培養基

半固體培養基主要用於細菌動力試驗,有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外,在穿刺線兩側也可見羽毛狀或雲霧狀混濁生長。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長,穿刺線兩邊的培養基仍然澄清透明,為動力試驗陰性。道客巴巴

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