Transwell 侵襲實驗總結

我的課題涉及 Transwell 侵襲實驗,因此在這裡和大家分享 Transwell 侵襲實驗。

實驗用品

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Transwell 小室

我用的是 ECM554,用完後擦去基質膠,再用胰酶和 75% 酒精泡,可以把膜洗得很乾淨,用前用紫外裡外都照 30 min。處理方法:用棉簽輕輕擦去膠和反面細胞,清水沖洗,超聲清洗,低檔,30 min,清水 3×5 min,蒸餾水 3×5 min,室溫涼幹,用前紫外線小室正面 3 h,反面 6 h,微波,低火 10 min×2。

因為我買的是鋪好膠的,所以沒買 Matrigel,二次利用的小室只用來做不需要鋪膠的遷移實驗。以前的 Chemicon ECM550 系列,膜很結實,擦不壞,可以反復用很多次。

Transwell 小室用過後,可把原來的膜切下,貼上 osmonic 公司的膜,這樣又可以用了,有興趣的可以試試。使用方法:trasnwell 小室做一次後,將原來的膜去掉,重新泡酸,泡酒精,使用前照紫外,然後用女士用指甲油(注意用無色較稀的)將 osmonic 公司的膜貼上,剪掉多餘的邊緣。再照紫外。

上層培養液

上層培養液採用無血清培養基,為維持滲透壓,需加入 0.05%-0.2% BSA。

細胞

有侵襲能力的細胞才可用於 Transwell 侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測 MMPs 的表達,特別是 MMP-2 的表達。如果不清楚細胞 MMPs 的表達情況,就盲目進行 Transwell 侵襲實驗,可能會造成不必要的浪費。

另外,為了讓實驗結果更明顯,可先撤血清讓細胞饑餓 12-24 h,再進行實驗。

基質膠

常用的是人工重構基底膜材料 Matrigel,主要成分為層黏連蛋白和 Ⅳ 型膠原。Matrigel 是一種細胞外基質,4時是液體,在 37會逐漸凝固成膠狀,不可逆。同樣的東西在 sigma 叫 ECM。如果購買的小室是已經鋪好基質膠的,那麼 Matrigel 就不需要購買了。

下層培養液

下層常用含 5%-10% FBS 的培養基,具體濃度根據細胞侵襲力而定,侵襲力弱的細胞可適當提高 FBS 濃度。下層也可用趨化因子,也可將將纖維黏連蛋白加入下層培養液作為趨化因子,但我認為 FBS 仍是最合適的。

細胞培養板

常用於 Transwell 侵襲實驗的細胞培養板有6 孔板、12 孔板、24 孔板等,以 24 孔最常用。需注意,細胞培養板應當與購買的 Transwell 小室相配套。

相關信息

此外,膜的下室面可塗上纖維黏連蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上,也可用膠原(collagen)或明膠(gelatin)。

很多人認為這不是必須的,而且我也是不塗的,細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。也有人認為,如果培養時間很長(>24 h),細胞還是會掉到下室裡面去,所以有條件的話,最好還是在膜下層塗上 FN。

另外,膜下層塗上 FN 還有一定的趨化作用。

實驗步驟

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Transwell 小室制備

1. 1 無基質膠 Transwell 小室制備

① 包被基底膜

用 50 mg/L Matrigel 1:8 稀釋液包被 Transwell 小室底部膜的上室面,4℃ 風幹。如果需要在下室面鋪 FN 的話,可將 200 μL 槍頭的尖端剪掉,吸取 FN 均勻塗抹在小室的下面。用膠原(collagen)的話,一般配成 0.5 mg/mL,直接用槍吸了塗在膜上。

② 水化基底膜

吸出培養板中殘餘液體,每孔加入 50 uL 含 10 g/L BSA 的無血清培養液,37℃,30 min。

另一方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋後的 Matrigel (3.9 μg/μL)60-80 μL (注意體積不可太大,以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好),置 37℃ 30 min 使 Matrigel 聚合成凝膠。

1. 2 有基質膠的 Transwell 小室制備

按照 ECM550 系列說明書要求,將小室放入培養板中,在上室加入 300 μL預溫的無血清培養基,室溫下靜置 15-30 min,使基質膠再水化,再吸去剩餘培養液。

制備細胞懸液

1. 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓 12-24 h,進一步去除血清的影響。但這一步並不是必須的。

2. 消化細胞,終止消化後離心棄去培養液,用 PBS 洗 1-2 遍,用含 BSA 的無血清培養基重懸。調整細胞密度至 1-10×100 000,個人認為不要超過 5×100 000。

具體實驗時採用密度要自己摸索,因為不同細胞,其侵襲能力是不同的。細胞量過多,穿過膜的細胞會過多過快,如果最後用計數法統計結果的話將難以計數。而過少的話,可能還沒到檢測的時間點,所有的細胞都已穿過,因此最少也要保證在收樣的時候,上室內還要有一定量的細胞存在。

對照組和處理組盡量不要分開計數,因為細胞數目的差異會嚴重影響實驗結果。如果需要對細胞預處理而不得不分開計數,那麼計數一定要多重復幾次,力求準確,盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。

接種細胞

1. 取細胞懸液 100-200 μL 加入 Transwell 小室,不同公司的、不同大小的 Transwell 小室對細胞懸液量有不同要求,請參考說明書。24 孔板小室一般 200 μL。

2. 24 孔板下室一般加入 500 μL 含 FBS 或趨化因子的培養基,不同的培養板加的量有不同要求,具體請參考說明書。這裡要特別注意的是,下層培養液和小室間常會有氣泡產生,一旦產生氣泡,下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,一旦出現氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進培養板。

3. 培養細胞:常規培養 12-48 h(主要依癌細胞侵襲能力而定)。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外,處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

以我的課題為例,我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力,還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用 MTT 篩選出的 72 h 的 IC50。用這個濃度處理細胞,24 h 內對細胞增殖並無明顯抑制,但 24 h 後,抑製作用就開始出現了。

所以,用這個濃度來做 Transwell,處理時間也必須限定在 24 h 內,否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡,使處理組細胞數目少於對照組,那麼就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少,究竟是由於侵襲被抑制引起,還是處理後細胞數目本身就比對照組少而引起的了。

時間過長不可以,同樣,過短也不行,因為細胞內會有一定量的 MMPs 儲存,短時間內可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去,進而發揮作用,影響 MMPs 表達,到最後釋放到培養基中,還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點,也可選擇多個時間點研究時間依賴效應,但前提是這個時間範圍內細胞數目不能有明顯變化。

另外,我看到細胞在小室內的形態不是正常培養貼壁的形態,而是圓形的,仍是懸浮時的形態,不過會聚集成團,所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張,是正常現象。

在培養過程中,膜下會逐漸有少量小氣泡產生,這是正常現象,可不予處理,但我遇到過培養一段時間後,膜下出現了大氣泡,幸虧及時發現,否則後果將非常嚴重。

作者:丁香園站友 lwjssry
題圖來源:丁香園

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Transwell 侵襲實驗總結

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