HBV沾染對人工輔助生殖的影響及其防范對策






1 HBV感染對人工輔助生殖的影響

ART是通過在體外收集精液,控制性超促排卵後取卵,將精子和卵子行體外受精(IVF)或卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)等方法,發育成早期胚胎後行胚胎移植回母體子宮,經妊娠後分娩的過程。本章節將從ART中女性及男性生殖細胞、實驗環境、妊娠結局和子代健康等方面來探討HBV感染對ART的影響。

1.1 HBV感染對女性生育能力及生殖細胞的影響

Lee等和周旭平通過評估卵巢儲備能力以及卵巢對超促排卵的反應來判斷HBV感染和未感染的女性生育能力是否有區別,他們從ART過程中使用的促性腺激素劑量、血促性腺激素持續時間、≥16 mm卵泡數、人絨毛膜促性腺激素使用當天雌二醇水平、獲得的卵母細胞數等發面比較發現,女性HBV感染者與未感染者的卵巢反應無明顯差別。然而柳榴等卻發現HBV感染的女性中,HBV DNA高拷貝數時可使卵巢儲備功能低下。

母嬰之間的垂直傳播是HBV傳播的主要途徑之一,分為產前傳播、產時傳播及產後傳播。經生殖細胞傳播是產前傳播的主要方式。Ye等通過免疫組化及原位雜交的方法在HBV感染的女性卵母細胞中發現HBsAg、HBcAg和HBV DNA,同時HBcAg和HBV DNA可見於卵母細胞的不同階段。還有學者在卵母細胞及胚胎中也發現HBsAg及HBV DNA,且血清HBV DNA水平與卵母細胞及胚胎的HBV DNA陽性率呈正相關。有試驗從引產的早期胚胎(46 d內)發現HBsAg,此時胎盤循環並沒有形成,其父親HBsAg陰性,這間接證明了HBV可通過卵母細胞傳給胚胎。在動物實驗中發現HBV DNA能夠穿過透明帶和卵細胞膜整合至小鼠的卵母細胞基因組中。這些均提示HBV可在卵母細胞內復制,通過受精方式傳遞給早期胚胎,垂直傳播給子代。

有趣的是,在HBV感染的女性的不同卵母細胞中有的表達HBV DNA,有的不表達,具體機制目前還不清楚,這就是為什麼HBV陽性女性的後代有的感染HBV,有的沒有。分析ART獲得的卵母細胞發現,感染模式僅HBsAg陽性的女性,卵母細胞及胚胎中HBV感染率是77%,在同時合併HBeAg陽性或HBV DNA陽性時,感染率為50%~100%,與自然妊娠過程中HBV傳染率無差異。

1.2 HBV感染對男性生殖細胞的影響

早在1985年時,在HBV攜帶者的精子中發現了HBV DNA,隨後多項研究表明HBV DNA可穿過血睪屏障,進入男性的生殖細胞,整合到基因組及染色體中,增加基因組的不穩定性,引起精子畸變、粉碎、斷裂。葉峰等通過檢測9例HBV感染的父親體外受精後遺棄的共18個胚胎的HBV mRNA,結果顯示陽性率為1/18(5.6%)。這些均提示HBV可通過精子以受精方式傳遞給早期胚胎並在其中復制,垂直傳播給子代。

然而關於HBV感染是否影響精子的功能目前存在爭議。多項研究發現HBV感染者精子存活率、正常形態率、數目、精液密度均較對照未受HBV感染的不孕組降低。Lee等收集了154例HBsAg陽性和1473例HBsAg陰性患者的精液,發現HBsAg陽性組的精子正常形態率較HBsAg陰性組低。Lorusso等從精液的濃度、精子存活率、正常形態率方面比較發現HBV感染組(30例)較未感染組(130例)低。Qian等發現正常對照組(30例)患者的精子的量、pH值、密度、精子存活率、形態正常率較未受HBV感染的不育組(30例)高,比受HBV感染的不育組甚至更高。Zhou等通過比較457例HBV陽性和459例HBV陰性的精液,發現HBV感染者精子的量、形態、運動能力較未感染組低。Oger等通過比較32例HBV感染和64例未感染者的精子運動能力,發現HBV感染組明顯低於未感染組。

HBV感染增加了精子細胞壞死和凋亡的比例,破壞了精子膜的完整性,引起精子線粒體膜喪失,導致精子的功能降低。HBV包膜蛋白的主要成分HBs蛋白可通過促進ROS生成、脂質氧化,激活caspases以及DNA降解,從而加速精子細胞凋亡,使細胞膜完整性喪失,導致精子失能,影響受精能力。

其他學者認為精子參數比如精液密度、精子運動能力、精子數量及形態與未受HBV感染的不孕男性之間沒有區別。另外,精液的質量與HBV DNA載量是否呈負相關仍沒有統一定論,Vicari等認為HBV DNA載量越高,精液質量越低,而Oger等則認為兩者之間沒有相關性。

1.3 實驗室交叉傳播風險

在卵泡液和精液中均可發現HBV DNA,若操作不當、管理不到位,實施ART過程中可將病毒傳播給配子或胚胎,尤其在凍融過程中,凍存管發生破裂或樣品露出,污染液氮儲存罐,有傳染給其他未感染者的配子及胚胎可能,發生交叉感染。另外,實驗室醫務人員可能會通過針刺、皮膚黏膜損傷後接觸而感染,受感染後的實驗人員也會成為傳染源,在實施ART操作中將病毒傳給配子或胚胎。

1.4 HBV感染對ART妊娠結局的影響

目前關於HBV感染對ART妊娠結局包括受精率、胚胎質量、著床率及妊娠率的影響一直存在爭議,報導結論並不一致。

Lee等發現夫妻雙方均為HBV感染者的妊娠率及活產率與夫妻單方HBV感染及雙方HBV均陰性者無明顯區別,認為HBV感染對ART結局無明顯影響。還有學者發現男性HBV感染時即使精子功能或形態受影響,但是對ART妊娠結局沒有影響,他們認為精子形態學評估並不能預測ART的結局。Shi等和Oger等發現男性HBV感染者行IVF時盡管受精率較陰性對照組低,但是2組的胚胎質量、著床率及妊娠率相當。可能因為即使精子功能受影響,受精率低或者正常,在ART實施過程中,當正常的精子形態低於3% 時,採用ICSI技術,從而補償了精子受損引起的不良反應。另外在ART操作過程中往往會選擇高評分的胚胎及在胚胎評分低時增加胚胎移植數量,而著床率和妊娠率與胚胎質量及胚胎轉移數有關,這就是對ART妊娠結局無影響的原因。

Pirwany等以年齡分組發現HBV感染的夫婦著床率及妊娠率較同齡對照組低。女方血清HBV DNA≥1.0×10^5拷貝/ml時ART的流產率顯著增加。Lam等則研究得出女性HBV感染者行ART後較HBV陰性組有高著床率、臨床妊娠率和持續妊娠率。各項結論的不一致性可能與不同地區HBV亞型不同、樣本數、子宮內膜情況以及其他一些來自母體方面的不可控的因素有關。

另外,通過比較ICSI和IVF發現,男性HBV感染時,行ICSI時妊娠結局較HBV陰性對照組低,而行IVF治療時,妊娠結局卻無影響。其原因可能是ICSI主要用於精液嚴重異常的夫婦,如正常精子形態低於3%或小於10萬個活動精子等。

1.5 HBV感染者行ART母嬰健康及子代感染率狀況

關於HBV感染者行ART後母嬰健康狀態的隨訪研究並不多。黃舒昊和倪麗莉分別通過隨訪行ART助孕妊娠成功HBV攜帶和非HBV攜帶的不孕夫婦,發現HBV攜帶者實施ART不會明顯增加妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、前置胎盤、卵巢過度刺激綜合征等並發症。但是HBV攜帶者ART後孕期肝功能損害的發生率,黃舒昊統計為4.46%,倪麗莉統計為15.22%,但均低於HBV攜帶者的自然妊娠資料(25%~47%)。新生兒窒息率和子代出生缺陷HBV攜帶和非HBV攜帶的不孕夫婦無區別,但對比IVF和ICSI兩種受精方式,黃昊舒發現ICSI方式受精的子代先天畸形風險顯著高於IVF方式受精,而倪麗莉卻認為HBV攜帶者IVF和ICSI方式受精之間子代先天畸形率差異無統計學意義。兩個試驗由於樣本量有限,需待進一步研究證實。

對於HBV感染者行ART後子代HBV感染率的情況,研究發現在乙型肝炎疫苗接種率相同的情況下,僅男方為HBsAg、抗-HBe 、抗-HBc 3項均陽性的夫婦,其子代感染率低於對應的自然妊娠,其餘HBV攜帶狀態下的子代感染率與自然妊娠相同,他們認為子代總體的HBV感染率較自然妊娠低。郝大勇等調查172例HBV陽性夫婦,經IVF助孕出生的224例嬰兒中,在正規接種乙型肝炎疫苗的情況下,無一確診感染HBV。女方HBV感染者,無論HBV攜帶形式如何,其子代感染率均低於對應的自然妊娠HBV感染率;男方HBV感染HBsAg、HBeAg、抗-HBc 3項均陽性患者(研究資料僅2例),子代感染率高於對應的自然妊娠資料外,其餘HBV攜帶狀態下的子代感染率均低於自然妊娠資料。且IVF和ICSI方式受精之間,HBV感染者子代HBV感染率無差異。因此體外培養不會增加HBV的垂直傳播風險,可能因為HBV攜帶者的血清、卵泡液、精液在體外培養過程中不斷被洗滌,反而減少了IVF及培養環境中的HBV含量,一定程度上降低了HBV通過感染配子途徑造成的垂直傳播。

1.6 ART中藥物對肝臟的影響

ART過程中涉及的藥物包括促排卵過程中使用的促性腺激素釋放激素激動劑、重組卵泡刺激素、人絨毛膜促性腺激素以及妊娠過程中治療先兆流產的藥物等。HBV感染者本身存在肝臟損傷的基礎,這些藥物的使用可能會誘發肝臟的進一步損害,如促性腺激素釋放激素激動劑有文獻報導可引起肝功能損傷,臨床上偶爾可見到一些治療先兆流產藥物引起肝功能損害。然而關於這類藥物對肝臟影響的研究和報導並不多,但臨床工作在應用時需略加重視,密切監測相關指標。

2 HBV感染者實施ART防范對策

2.1 ART前

HBV監測對於需實施ART的夫婦,為了減少HBV在ART中的傳播風險,需常規檢測乙型肝炎兩對半、HBV DNA以及肝功能等指標。其具體診療應與自然妊娠分娩相同。對於女性患者若肝功能異常,有治療適應證,應盡量在開展ART前應用干擾素(IFN)或核苷(酸)類藥物(NAs)治療,以期在ART前6個月完成治療,待肝功能好轉後再啟動ART周期。對於男性抗病毒應用IFN治療者,停藥6個月後可考慮ART;應用NAs者,尚無證據表明NAs對精子的不良影響,可在與患者充分溝通前提下考慮ART。鄭州大學第三附屬醫院生殖醫學中心要求在實施ART之前助孕者血清HBV DNA<1×10^4拷貝/ml。浙江大學附屬婦產科醫院生殖內分泌科將血清HBV DNA陽性和HBV感染伴肝功能損害列為禁忌證,待治療後HBV DNA轉陰、肝功能好轉後再啟動ART周期。妊娠期間需密切檢測肝功能,ALT輕度升高者可密切觀察,肝臟病變較重者,可使用替諾福韋酯或替比夫定抗病毒治療。

2.2 提高ART,減少HBV傳播

HBV感染者的精液及卵泡液中均存在HBV DNA,大量研究顯示,採取有效的精子洗滌方法,可以降低或去除精液中的病毒顆粒。通過洗滌卵冠丘復合體以及受精後轉移、更換培養液的方法可稀釋病毒拷貝數的作用,降低或阻斷胚胎被感染的危險,從而避免病毒垂直傳播,提高ART的安全性。

部分學者認為ICSI技術要求單個精子與單個卵子接觸,可以很大程度上避免暴露於可能被HBV污染的精液和卵泡液中,減少病毒傳播的風險。而另有不同的觀點認為ICSI的注射操作很可能直接將病毒顆粒帶入卵母細胞,還有學者認為IVF和ICSI對於HBV的傳播無差別。

2.3 加強實驗室管理,防止交叉感染

在實施ART之前,HBV檢測為必須檢測的一項指標,HBV感染者實施ART時,建議將感染HBV與未感染HBV夫婦採用不同的實驗室。放置過污染樣品的培養箱使用完畢後應經過嚴格的清潔消毒處理方可使用。液氮儲存罐最好分為污染和非污染罐,將精子、卵母細胞、胚胎分開保存。

所有實驗室人員需進行乙型肝炎疫苗接種;嚴格遵守實驗室安全規定,避免針刺;穿防護服,使用防護用品;嚴格遵守手部衛生;嚴格執行傳染性廢物管理,防止向實驗室人員傳播。實驗室空氣要用Ⅱ類垂直層流櫃100%再循環過濾。

2.4 母嬰傳播阻斷

當母親血清HBV DNA水平>2×10^6 IU/ml時,在妊娠第24~28周開始給予替諾福韋酯或替比夫定口服抗病毒,使孕婦產前血清中的HBV DNA水平降低,提高母嬰阻斷成功率。建議於產後1~3個月停藥,停藥後可母乳餵養。

乙型肝炎疫苗接種是預防HBV感染最有效的措施。孕婦HBsAg陰性時,新生兒按「0、1、6個月」 3針方案接種疫苗,對HBsAg陽性母親所生新生兒,應在出生24 h內盡早(最好在出生12 h)內注射乙型免疫球蛋白和全程接種乙型肝炎疫苗(即「0、1、6個月」3針方案)。採取正規預防措施後,對HBsAg陽性而HBeAg陰性孕婦的新生兒保護率為98%~100%,對HBsAg和HBeAg均陽性孕婦的新生兒保護率為85%~95%。新生兒在出生12 h內注射乙型肝炎免疫球蛋白和乙型肝炎疫苗後,可接受HBsAg陽性母親的哺乳。

3 結論與展望

隨著ART需求的增多,HBV感染對ART的影響受到了更多的關注和研究。無論男方或者女方感染HBV,均可在ART過程中經生殖細胞(精子和卵母細胞)垂直傳播至子代;HBV還可通過實驗室交叉傳播。通過監測夫婦雙方HBV、加強實驗管理、提高實驗技術、免疫預防等方法可有效阻斷HBV在ART中對子代的傳播。

目前,國內外在HBV感染對ART影響的研究主要集中在對生殖細胞作用方面,對妊娠結局、母嬰健康狀態、不同的受精方式之間是否有區別等回顧性的研究相對較少,結論尚未統一,具體機制仍有待進一步的闡述。進一步的探究可促進ART的不斷改進和提高,降低HBV傳染風險。

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引證本文:朱彤,李成忠. HBV感染對人工輔助生殖的影響及其防范對策[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2019, 35(7): 1425-1429.

本文編輯:林姣

公眾號編輯:邢翔宇